Formatosi alla scuola dei monaci pittori del monastero della Trinità a Zagorsk (Mosca) e monaco egli stesso, ebbe forse come primo maestro Prochor di Gorodec. Accanto a quest'ultimo e a Teofane il Greco, del quale subì l'influsso, Rublëv attese alla decorazione della cattedrale dell'Annunciazione nell'attuale Cremlino a Mosca (1405) e all'esecuzione di alcuni dipinti dell'iconostasi, in seguito trasferita nella nuova cattedrale (1484).
In queste opere, come nei precedenti affreschi della cattedrale della Dormizione a Zvenigorod (verso il 1400; Ss. Floro e Lauro), affiora, all'interno dell'ancor salda tradizione figurativa bizantina, la tendenza ad un'espressione più intimamente naturalistica e formalmente più limpida e monumentale.
Gli affreschi nella cattedrale della Dormizione di Vladimir, condotti in collaborazione con l'amico Daniil (1408, Giudizio Universale), alcune tavole dell'iconostasi della stessa Chiesa (Mosca, Galleria Tret'jakov; San Pietroburgo, Museo Russo) e la celebre icona della Trinità angelica per l'omonima Chiesa moscovita (verso il 1411; Mosca, Galleria Tret'jakov) segnano i massimi raggiungimenti stilistici di Rublëv: nella composizione, che spesso riecheggia schemi circolari, e nelle figure inscritte in schemi romboidali irregolari, egli raggiunse vertici d'armonico equilibrio, esaltato dal fluido snodarsi dei contorni che delimitano ampie campiture di colore in tonalità acide e brillanti.
Della fase conclusiva dell'attività di Rublëv sono tre icone dell'iconostasi della nuova cattedrale della Trinità di pietra bianca a Mosca, che si aggiungono ad alcune altre, documentate o attribuite, conservate alla Galleria Tret'jakov di Mosca.
Liberandosi degli ormai svuotati moduli formali bizantini, Rublëv ne reinterpretò la sostanza e rianimò l'antica iconografia con un'intensa spiritualità; il suo stile, che rinnova la tradizione con la grazia serena del tratto e del colore, lasciò un'impronta sulla scuola moscovita di pittura.
